تجهیزات آزمایشگاهی- تجهیزات آنالیتیکال- دستگاه hplc
تاریخچه دستگاه HPLC
كروماتوگرافي يا نوشتن با رنگ، در ابتدا توسط دانشمند روسي به نام Mikhail Tsvet در 1900 به كارگرفته شد. او كار با كروماتوگرافي را در دهه ي اول قرن بيستم ادامه داد و ابتدا ازآن براي جداسازي رنگدانه‌هاي گياهان استفاده كرد. از آنجا كه اين اجـزا، رنـگ‌هاي متفاوتي دارند (سبز، نارنجي و زرد) لـذا نـامگـذاري اين تكنيك بر همين اساس صورت گرفته است. انواع جديد كروماتوگرافي در طول 1930 و 1940 ايجاد شدند و اين تكنيك را بــراي بـسـيــاري از فــرايـنــدهــاي جـداسـازي مفيـد كردند.
تكنيك كروماتوگرافي در نتيجه ي كار Archer Hohn Porter Martin و Richard Laurence Millington Synge در دهه‌هاي 40 و 50 به صورت اساسي توسعه يافت.
عبارت هاي اصلي در كروماتوگرافي
آناليت ماده‌اي كه هدف، جداسازي آن در طول كروماتوگرافي است.
كـرومـاتـوگـرافي تحليلي براي تعيين وجود و غلظت آناليت در يك نمونه استفاده مي‌شود.
كروماتوگرام خروجي ديداري كروماتوگراف است. در حالتي كه جداسازي به صورت بهينه انجام شده باشد، قله‌هاي متفاوت روي كروماتوگرام، متناظر با اجزاي مختلف در تركيب است.
مـحـور x زمـان مـاندگاري و محور عمودي، سيگنال متناظر با پاسخ ايجادشده توسط آناليت‌هاي موجود در سيستم است.
كروماتوگراف دستگاهي است كه امكان جداسازي حرفه‌اي را فراهم مي‌كند، به عنوان مثال جداسازي كروماتوگرافيك مايع يا گاز.
محصول شويش يا Eluate فاز متحركي است كه از ستون خارج مي‌شود.
شوينده يا Eluent حلالي است كه آناليت را حمل مي‌كند.
سري eluotropic ليستي از حلال‌هاست كه طبق توان شويندگيشان مرتب شده‌اند.
فاز ثابت (immobilized)، يك فاز ايستا است كه درون ستون كروماتوگرافي ثابت شده است.
فاز متحرك فازي است كه در يك جهت معين حركت مي‌كند. مي‌تواند مايع (LC)، گاز (GC) يا يك مايع (supercritical (SFC باشد. فاز متحرك متشكل از نمونه اي كه قرار است جدا/تحليل شود و حلالي كه نمونه را در طول ستون پيش مي‌برد، است. در مورد HPLC فاز متحرك متشكل از حلال (هاي) غيرقطبي مانند hexane در فاز طبيعي يا حلالهاي قطبي در كروماتوگرافي فاز معكوس و نمونه اي كه قرار است جدا شود است. فاز متحرك در طول ستون كروماتوگرافي (فاز ايستا) حركت مي‌كند و در اين زمان، نمونه‌ها با فاز ايستا تعامل مي‌كنند و جدا مي‌شوند.
كروماتوگرافي توليدي براي جداسازي مقادير كافي از يك ماده براي استفاده‌هاي بعدي- و نه تحليل - استفاده مي‌شود.
زمان ماندگاري زماني است كه طول مي‌كشد تا يك آناليت خاص، تحت شرايط set از سيستم عبور كند (از ورودي ستون تا دتكتور.)
نمونه ماده اي است كه در كروماتوگرافي تحليل مي‌شود. مي‌تواند يك جزء داشته باشد يا تركيبي از اجزاي مختلف باشد.
ماده ي حل شده يا Solute اجزاي نمونه در كروماتوگرافي partition هستند.
حلال هر ماده اي است كه بتواند ماده ي ديگري را حل كند و به صورت خاص، به فاز مايع متحرك در كروماتوگرافي مايع گفته مي‌شود.
فاز ايستا ماده اي است كه در فرايند كروماتوگرافي در جاي خود ثابت است؛ به عنوان مثال، لايه ي سيليكا در كروماتوگرافي لايه نازك.
اجزاء و قسمتهاي مختلف دستگاه HPLC
مخازن حلال
كه در آنها فاز متحرك و يا حلالهاي شستشو دهنده ستون ريخته شده است.
موتور يا پمپ
چون ستونها نسبتا طويل و اندازه ذرات كم است. به اين جهت قابليت نفوذ كم مي شود و براي اين كه حلال جريان داشته باشد بايد فشاروجود داشته باشد. براي ايجاد فشار از پمپ يا موتور استفاده مي كنيم. پمپ فشاري حدود psi 4500 مي تواند ايجاد كند. و بايد بتواند فشار ثابت ايجاد كند. حلال توسط پمپ با فلوي ثابتي بر روي فاز ثابت حركت داده مي شود. حداكثر فلوئي كه فاز متحرك مي تواند داشته باشد ml/min 2.5 است. و بسته به نوع كاري كه مي خواهيم انجام دهيم فلو فرق مي كند، هر چه فلو كمتر باشد، فاصله ي پيك ها بيشتر است. چهارمخزن داريم مخزنD, C, B, A ميزان فشار بستگي به فلوي ما دارد وقتي فلو ml/min 0.8 است ميزان فشار حدود psi 1500 مي شود. ميزان فشار بستگي به نوع ستون دارد حداكثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداكثر تغييرات فشار Psi 100 است. حداكثر فلو ريت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن مي گيرد و با سرعت گذر ثابتي آن را بداخل دستگاه وارد مي كند. در دماي آزمايشگاه كار مي كنيم.
انواع پمپ
-
پمپ های پیستونی
-
پمپهای جابه جایی یا سرنگی
-
پمپ های فشار ثابت یا بادی
ویژگی سیستم های پمپ کننده در hplc
-
تولید فشارهای تا PSi600
-
خروجی بدون تپ
-
سرعت جریان در گستره 1/0 تا ml/min10
-
کنترل جریان و تکرارپذیری جریان تا 5/0% نسبی ویا بهتر
-
اجزای سازنده مقاوم در مقابل خوردگی (فولادهای مختلف زنگ نزن یا تفلون)
تزریق نمونه
از سرنگهاي مختلف با ظرفيت هاي مختلف استفاده مي كنيم. حجم تزريق 30 ميكروليتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتي بنام گارد كالوم يا پري كالوم مي شود كه محافظ ستون است، طول كاردكالوم حدو يك سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پركننده آن از جنس ماده پركننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصي داشته باشد يا با ماده داخل ستون واكنش ايجاد كند درگاردكالوم انجام مي شود و به ستون آسيبي نمي رسد.
ستون
طول ستونهاي دستگاه حدود 30-10 سانتي متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترين ستون C18 ، ODS آکتا دسيل سيلان است، ستونها را پس از اتمام كار بايد با محلولهاي شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده كرديم ستون را با آب و متانل و بعد با متانل خالص شستشو مي دهيم. فاز ثابت بصورت ذرات ريزي در داخل ستون قرار گرفته است. كه بر اثر چسبيدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرك جداسازي انجام مي شود. نمونه ابتدا وارد گاردكالوم و بعد وارد ستون مي شود، گارد كالوم را پس از مدتي بايد عوض كرد، ODS اكتا دسيل سيلان گروههاي الكيل غيرقطبي زيادي دارد، فاز متحركي كه استفاده مي كنيم قطبي است. فاز متحرك و ماده پركننده ستون از نظر قطبيت بايد عكس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معكوس هست.
اگر فاز ثابت قطبي و فاز متحرك غيرقطبي باشد سيستم را فاز نرمال و در صورتي كه ستون غيرقطبي و حلال قطبي باشد. سيستم را فاز معكوس مي گويند. مشتقات آلكيل سيلان و فنيل سيلان ايجاد ستونهاي غير قطبي مي كنند و معمولا ستون غير قطبي و فاز متحرك قطبي است بنابراين از فاز معكوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ يا Stainless steel است.
انواع ستون در hplc
-
ستون های کروماتوگرافی مایع
-
ستون های تجزیه ای
-
ستون های محافظ
انواع پر کننده های ستون در hplc
-
پرکننده ذرات پوسته دار
-
پرکننده متخلخل
پرکننده ذرات پوسته دار:
از دانه های شیشه ای یا بسپاری نامتخلخل کروی با قطر نوعی از 30 تا 40 میکرومتر تشکیل شده است و جنس لایه متخلخل سیلیس , آلومین و یا یک رزین تبادل یونی روی سطح این دانه ها رسوب داده شده است. ممکن است دانه ها در اثر اعمال شیمیایی دارای سطحی آلی شوند. اخیرا پرکننده های پوسته دار عمدتا در ستون های محافظ و نه برای ستونهای تجزیه ای به کار می روند.
پرکننده متخلخل:
این نوع پر کننده ها از ریز ذراتی با قطری در گستره 3 تا 10 میکرومتر تشکیل میشود برای یک اندازه معین تلاش میشود تا گستره اندازه ذره به حداقل برسد.این ذرات از سیلیس –آلومین و یا رزین تبادل یونی تشکیل شده اند که سیلیسی متداول تر است. ذرات سیلیس از تجمع ذرات سیلیس ریز میکرون در شرایطی سنتز می شوند که به ذرات بزرگتر کاملا یکنواخت منجر شوند.
آشکارسازها در hplc
رديابها بايد حساس باشند و اثر مخرب بر روي اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسيعي براي غلظت بايد خطي باشد. عامل وجودی آشکارگر در hplc, آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می آید. یک سری گسترده از وسایلی که بعضی از آنها پیچیده و حساس هستند به عنوان آشکارگر مورد استفاده قرار می گیرند. آشکار سازها به دو گروه اصلی آشکار سازهای با خاصیت گروهی و آشکارسازهای با خاصیت جسم حل شده طبقه بندی میشوند.
تعریف دو نوع اصلی آشکارساز:
آشکارسازها با خاصیت گروهی : به خاصیت فاز متحرک مانند ضریب شکست ثابت دی الکتریک یا چگالی که با وجود جسم حل شده مدوله میشودجواب میدهند.
آشکارسازها با خاصیت جسم حل شده: به خاصیتی از جسم حل شده مانند جذبUV – فلوئورسانس یا جریان نفوذ, که فاز متحرک فاقد آن است جواب میدهد.
مشخصات آشکارساز ایده آل
علاوه بر اینکه آشکار سازها در این روش نیازی ندارد به گستره ای به آن وسعت از دما جواب بدهد. علاوه براین برای کاهش پهن شدگی منطقه , آشکار ساز HPLC باید حداقل حجم درونی را داشته باشد
-
حساسیت کافی
-
پایداری خوب و تکرار پذیر
-
قابلیت اعتماد بالا و سهولت کاربرد
-
زمان جواب کوتاه که مستقل از سرعت جریان است
انواع آشکارساز
-
آشکارسازهای جذبی
-
آشکارسارهای فلورسانسی
-
آشکارسازهای ضریب شکست
-
آشکارسازهای الکتروشیمیایی
ثبات (ركوردر) در hplc
در اثر حركات قلم پيك هائي رسم مي شود كه به مجموعه آنها كروماتوگرام مي گويند.به طريق كيفي پيك ها را براساس زمان باز داري يا نگهداري يا Retention time مي شناسند. زمان بازداري فاصله زماني از لحظه تزريق تا رسيدن به نقطه اوج يك پيك است.
براي محاسبه كمي سطح هر نوار جذبي را حساب مي كنيم، سطح هر نوار جذبي متناسب با مقدار جسم است كه بوسيله انتگراتور يا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست مي آيد سطح هر نوار جذبي يعني حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است. روش بريدن نوار و وزن كردن آنها روش قديمي است. ولي امروزه توسط سطح سنج يا انتگراتور بدست مي آيد خود دستگاه AUC را مشخص مي كند. مي توان از ارتفاع هم استفاده كرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص كنيم AUC و ارتفاع با يك دستور ساده قابل تبديل بهم هستند. روش رسم منحني را انجام مي دهيم. در محور افقي غلظت ها و در محور عمودي AUC . بعد از رسم منحني استاندارد، غلظت مجهول را از روي رسم منحني بدست مي آوريم.
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا سریعترین رشد را در بین تمام فنون جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره میلیارد دلار داشته است .دلیل این محبوبیت:
-
حساسیت روش
-
سازگاری آن برای انجام اندازه گیریهای کمی صحیح
-
مناسب بودن آن برای جداسازی گونه های نافرار یا ناپایدار گرمایی
-
کاربرد گسترده آن برای مواد پراهمیت در صنعت
-
زمینه های مختلف علوم و جامعه
کاربرد های کروماتوگرافی مایع hplc
-
برای مواد حل شده ای که وزن مولکولی بزرگتر از 10000 دارند کروماتوگرافی طردی
-
برای گونه های یونی با وزن مولکولی پایین کروماتوگرافی تبادل یونی
-
گونه های کوچک قطبی اما نایونی از کروماتوگرافی تقسیمی
-
برای جداسازی گونه های ناقطبی , ایزومرهای ساختاری و دسته ترکیباتی از قبیل هیدروکربنهای آلیفاتیک از الکلهای آلیفاتیک از کروماتوگرافی جذب سطحی استفاده می کنند.
تجهیزات جانبی HPLC شامل موارد زیر می باشد
-
ستونهای کاپیلاری و ستونهای استیل Packed
-
ستونهای HPLC
-
سپتومهای مختلف دستگاههای گازکروماتوگراف
-
سرنگ های کروماتوگرافی – سرنگهای گازی و........
-
فرول گرافیتی ستون کاپیلاری- لاینر – گاز پیوریفایر تراپ – فرول گرافیتی ستون Packed
-
ژنراتور گاز هیدروژن – ژنراتور گازازت و ژنراتور گازهوا
-
مولتی ژنراتور گاز (تولید هیدروژن،ازت و هوا در یک دستگاه)
-
کمپرسور هوا بدون روغن
-
لوله های رابط – مهره اتصال گازها – رگلاتور گاز
-
سیلندر گازهای هوا – ازت – هیدروژن با خلوص بالا
مشكلات گزارش شده در استفاده در hplc
آماده سازي نمونه‌ها تاثير زيادي روي كيفيت آناليز دارد. مسائلي مانند عوامل تداخلي در نمونه يا تغيير در pH كه هر دو از آماده سازي اسيدي ناشي مي‌شوند؛ عوامل تداخلي حذف نـشـده تـوسـط اولـتـرافـيـلـتـراسـيـون؛ و تـركـيـب پـروتئيني بيش از حد. راهكارهاي مختلف استانداردسازي نيز مي‌توانند ايجاد مشكل كنند: استانداردسازي خارجي مي‌تواند منجر به از دسـت رفـتـن مـتـغـيـر در طـول آمـاده سـازي و نـيـز تـزريـق مـتـغـير نمونه شود. در مقايسه استانداردسازي داخلي مي‌تواند دقت را محدود كند؛ چرا كه اندازه گيري صحيح دو قله، مشكل است.
مشكلات مرسوم در سيستم‌هاي HPLC، خطوط پايه ي نويزي و دريفت در خط پايه است. نرخ كند جريان يا سيستم گراديان خطادار مي‌تواند منجر به افزايش زمان ماندگاري نمونه شود. بارگذاري بيش از حد ستون با نمونه يا تخريب packing ستون مي‌توان رزولوشن آن را كاهش دهد.
پمپ‌ها براي حداقل كردن پالس طراحي شده اند. به هر حال با هيچ روشي نمي توان پالس‌ها را به طور كامل حذف كرد. اين امر به ويژه در مورد دتكتورهاي الكتروشيميايي كه نسبت به انواع ديگر دتكتورها حساسيت بيشتري نسبت به پالس دارند، برقرار است.
زماني كه از دريچه‌هاي حلقه ثابت (روش حلقه ي كامل) استفاده مي‌شود، آلودگي ناشي از نمونه‌هاي قبلي مي‌تواند منجر به توليد نتايج غيرصحيح شود. حلقه بايد قبل از بارگذاري، با 5 تا 10 برابر حجم حلقه شسته شود.
توصيه‌هاي لازم در زمینه خرید دستگاه hplc
سيستم HPLC متشكل از مدول‌هاي مختلف است كه خريداران مي‌توانند از بين آنها براساس نيازهاي خود انتخاب كنند. به عنوان مثال، اگر تنها تعداد كمي نمونه به صورت روزانه آناليز مي‌شود، ممكن است انژكتور دستي كافي باشد. به علاوه دتكتورهاي متفاوتي براي آناليت‌هاي بيولوژيكي مختلف، مناسب اند. اغلب توليدكنندگان سيستم را براي خريدار به صورت سفارشي تنظيم مي‌كنند.
ممكن است در برخي كاربردهاي باليني، نياز باشد كه اين دستگاه‌ها تاييديه ي FDA براي كاربردهاي in vitro داشته باشند. توليدكنندگاني كه دستگاه‌هايشان اين كاربردها را دارند مي‌توانند مدارك مربوطه را در اختيار كاربران قرار دهند.
قبـل از خـريـد سيستـم HPLC خـريـداران بـايـد تعيين كنند كه آيا سازنده سيستم، تمام ستونهاي جايگزين و تداركات موردنياز را مي‌فروشد. اگر سازنده اين آيتم‌ها را نفروشد خـريـدار بـايـد بداند كه چه انواعي با دستگاه اين توليدكننده سازگارند و از كجا بايد آنها را تامين كند. برخي از تامين كنندگان، در صورت خريد عمده، تخفيف قابل توجهي در مورد معرف‌ها و ديگر تداركات ارائه مي‌كنند.
مـواد مصـرفـي بخـش عمـده اي از هـزينـه‌هاي عـمـلـكــردي را تـشـكـيــل مــي‌دهـنــد و ايــن هــزيـنـه مـي‌تـواند بسته به تخفيف‌هاي ارائه شده توسط تامين كننده، تا حد زيادي تغيير كند.
يك مساله ي مهم در مورد سيستم‌هاي HPLC، ارتباط آنها با كامپيوتر است. برقراري يك ارتباط مـوثـر بـا سـيـسـتم اطلاعات آزمايشگاهي (LIS) يا سـيـسـتــم كــامـيـپــوتـري مـركـزي بـراي وارد كـردن داده‌هاي تست، ارزيابي صحت تست، حفظ QC، كاليبره كردن، تست‌هاي كارائي و فايل‌هاي بيمار طبق رهنمودهاي CLIAضروري است
